H9C2细胞培养液诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.19.005

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (19): 2981-2986.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.19.005

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H9C2细胞培养液诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

黄吕，张辉，解力，李永林，张晓刚

重庆医科大学附属第一医院心内科，重庆市 400016

修回日期:2014-04-07 出版日期:2014-05-07 发布日期:2014-05-07
通讯作者: 张辉，医师，重庆医科大学附属第一医院心内科，重庆市400016
作者简介:黄吕，男，1987年生，汉族，重庆医科大学在读硕士，主要从事干细胞向心肌细胞诱导分化方面的研究。
基金资助:
重庆市卫生局医学科学技术研究重点项目(2009-1-51)

Differentiation of mesenchymal stem cells into cardiomyocyte-like cells induced by H9C2 cell culture medium

Huang Lv, Zhang Hui, Xie Li, Li Yong-lin, Zhang Xiao-gang

Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

Revised:2014-04-07 Online:2014-05-07 Published:2014-05-07
Contact: Zhang Hui, Physician, Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
About author:Huang Lv, Studying for master’s degree, Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
Supported by:
the Medical Science and Technology Project of Chongqing Health Bureau, No. 2009-1-51

摘要/Abstract

摘要：

背景：文献报道间充质干细胞经体外化学药物诱导或自体移植体内诱导或模拟心肌样微环境体外诱导等方法可不同程度的诱导心肌细胞分化，但这些方法诱导率低、操作复杂、毒副作用大。
目的：验证心肌细胞株H9C2细胞培养液对骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的诱导作用。
方法：运用全骨髓贴壁筛选法分离培养大鼠间充质干细胞，制备H9C2细胞培养液作为诱导培养液，将间充质干细胞诱导培养1，3，5，7 d；以单独10%F12-DMEM培养液培养的H9C2细胞为阳性对照组；单独10%F12-DMEM培养液培养的间充质干细胞为阴性对照组。用免疫荧光法和western-blot检测其肌钙蛋白T、心肌细胞结蛋白的表达，用实时荧光定量检测其心肌细胞特征性基因α-肌球蛋白重链和β-肌球蛋白重链mRNA的表达。
结果与结论：H9C2细胞培养液诱导间充质干细胞培养7 d，间充质干细胞增殖分化细胞中肌钙蛋白T阳性细胞达(16±7)%，显著高于对照组(P < 0.05)；与阴性对照组比较，western-blot检测诱导培养间充质干细胞后分化细胞肌钙蛋白T表达明显上调(P < 0.05)，结蛋白表达明显上调(P < 0.05)；RT-PCR检测分化细胞α-肌球蛋白重链与β-肌球蛋白重链mRNA表达均上调(P < 0.05)。结果提示H9C2细胞培养液能诱导间充质干细胞向心肌样细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 间充质干细胞, 骨髓间充质干细胞, H9C2, 心肌样细胞, 肌钙蛋白T

Abstract:

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells can differentiate into cardiomyocytes in vitro induced by different methods, such as chemical drug induction, autologous transplantation in vivo, and in vitro simulation of cardiac-like microenvironment, but these inducible methods show low induction rate, complex operation, and toxic side effects.
OBJECTIVE: To investigate the role of H9C2 cell culture medium in the differentiation of mesenchymal stem cells into cardiomyocyte-like cells.
METHODS: Mesenchymal stem cells were obtained by the whole bone marrow adherent culture and H9C2 cell culture medium was prepared as a culture medium. Then mesenchymal stem cells were co-cultured with H9C2 cell culture medium for 1, 3, 5, 7 days. H9C2 cells cultured in 10% Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham’s nutrient mixture F-12 served as positive control groups, while mesenchymal stem cells cultured in 10% Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham’s nutrient mixture F-12 as negative control group. Immunofluorescence and western blot assay were used to detect expression of myocardial cell junction protein (desmin) and troponin T. Real-time quantitative PCR was applied to detect mRNA expression of myocardial cell trait genes, α-cardiac myosin heavy chain and β-myosin heavy chain.
RESULTS AND CONCLUSION: After co-culture of H9C2 cell culture medium and mesenchymal stem cells for 7 days, the troponin T positive cells were up to (16±7)%, which was significantly higher than that of non-induced mesenchymal stem cells. Compared with the negative control group, the expression of troponin T protein and desmin after induction were significantly increased (P < 0.05) by western-blot detection; real-time PCR showed that the mRNA expression of α-cardiac myosin heavy chain and β-myosin heavy chain in differentiated cells were both up-regulated (P < 0.05). These findings suggest that H9C2 cell culture medium may induce the differentiation of mesenchymal stem cells into cardiomyocyte-like cells.

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Key words: mesenchymal stem cells, myocytes, cardiac, troponin T

中图分类号:

R394.2

黄吕，张辉，解力，李永林，张晓刚. H9C2细胞培养液诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(19): 2981-2986.

Huang Lv, Zhang Hui, Xie Li, Li Yong-lin, Zhang Xiao-gang. Differentiation of mesenchymal stem cells into cardiomyocyte-like cells induced by H9C2 cell culture medium[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(19): 2981-2986.

图/表（结果） 1

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引言

冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)在中国的发病率逐年提高，目前已成为国内心血管患者住院的主要原因。冠心病患者的严重表现是心肌梗死，梗死区域的心肌细胞由瘢痕组织代替，引起不同程度的心室重构，患者常常遗留不同程度的心功能不全，进而发展成心力衰竭；若抢救不及时，甚至会危及生命，心肌细胞坏死则是其病理基础^[1]。心肌细胞是终末分化细胞，心肌细胞再生极度缓慢困难。虽然近年来的研究表明，正常成人心脏每年约有少量的心肌细胞完成自我更新，但是心脏的自我修复能力还不能满足病理状态下心脏的损伤修复^[2]。因此，如何促进梗死部位心肌细胞的再生，成为预防心肌梗死后心力衰竭发生率及降低心梗后病死率的关键。随着科学技术的发展，近年来发展的心肌细胞移植技术，即向梗死心肌组织中移植有增殖潜能的细胞，由于其可以将具有向收缩功能的细胞分化潜能的细胞移植到心脏的缺血坏死部位，为治疗缺血性心脏病提供了新的方法^[3]。

成体干细胞是未分化细胞，存在于已经分化的组织中，在需要时可以自我更新并分化形成所在组织的类型的细胞，如造血干细胞、骨髓间充质干细胞等^[4]。骨髓间充质干细胞是一种具有强大增殖能力的非造血干细胞，属于成体干细胞，具有多向分化潜能，可在不同的诱导条件下分化为成内皮细胞^[5]、骨细胞、成软骨细胞^[6]、肌细胞^[7]、脂肪细胞、神经元、神经胶质细胞等^[8-9]。由于骨髓间充质干细胞来源充足、取材方便、操作简单、自体移植无免疫排斥以及其多向分化潜能等优势，是一种理想的心肌供体细胞。

近年的研究显示，间充质干细胞在不同条件下可被诱导分化为心肌样细胞。查阅国内外文献发现，文献报道的诱导方法有体外化学药物诱导、自体移植体内诱导、模拟心肌样微环境体外诱导等^[10-13]，可不同程度的诱导心肌细胞分化，但这些方法诱导率低、操作复杂、毒副作用大。为了进一步研究促使骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的方法及其诱导效果，本实验收集生长心肌细胞株H9C2细胞的培养液，称诱导培养液，将该诱导培养液加入骨髓间充质干细胞培养环境中，骨髓间充质干细胞经过诱导培养，观察各组细胞中心肌细胞特异性蛋白肌钙蛋白T、结蛋白、心肌肌球蛋白重链等表达的改变，探讨H9C2细胞培养液诱导骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞的作用及机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：单一样本观察。

时间及地点：实验于2012年12月至2013年7月在重庆医科大学附属第一医院实验楼完成。

材料：

实验动物：清洁级6周龄雄性SD大鼠，体质量(120± 10) g，由重庆医科大学动物实验中心提供。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的分离和培养：利用全骨髓贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞，6周龄雄性SD大鼠无菌条件下取双侧股骨和胫骨，剪断骨端，暴露骨髓腔，用生理盐水冲出骨髓，离心机离心(1 000 r/s，5 min)。然后弃去上清液，用含体积分数10%胎牛血清的F12-DMEM培养液重悬细胞，以1.5×10⁸ L^-¹浓度接种细胞于25 mL细胞培养瓶，置于37 ℃、体积分数5%CO₂恒温培养箱中培养。48 h后首次更换培养基，以后每3 d换液1次，换液后于显微镜下观察细胞生长情况和形态特征。待细胞达90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，以1∶2比例传代培养。研究证明传至第3代时间充质干细胞占贴壁细胞99%以上^[14]，纯度高，流式细胞仪检测CD44，CD90，CD105，阳性率可达到99.34%，99.34%，99.35%；取传至第3代的贴壁细胞进行试验。

H9C2细胞的培养及诱导培养液的制备：H9C2心肌细胞株来源于大鼠胚胎期心脏组织，具有部分心肌细胞特性。H9C2细胞复苏后培养在含体积分数10%胎牛血清的F12-DMEM培养液中，置于37 ℃的体积分数5%CO₂恒温培养箱中培养，一两天换液1次，并传代，将培养3 d的传代前的培养液吸出，经0.22 μm滤过膜过滤后，放于无菌容器中称诱导培养液，备用。

H9C2细胞液对间充质干细胞分化的诱导实验：实验分为3组，实验组将第3代间充质干细胞接种于盖玻片上，接种密度为1×10³/cm，置于六孔板中，将诱导培养液与预先配置的20%F12-DMEM培养液按照1∶1的比例混合并加入置有间充质干细胞的六孔板中，37 ℃，体积分数5%CO₂恒温培养箱中培养。阳性对照组采用单独10%F12-DMEM培养液培养的H9C2细胞。阴性对照组采用单独10% F12-DMEM培养液培养的间充质干细胞。

免疫荧光染色检测肌钙蛋白T阳性细胞率：实验组培养第1，3，5，7天分别取3孔细胞，PBS洗涤3次，以40 g/L多聚甲醛固定，PBS冲洗，5%BSA室温封闭，甩掉血清后，滴加山羊抗鼠的单克隆一抗cTnT(1∶200)，4 ℃低温过夜，PBS冲洗；滴加FITC标记兔抗山羊IgG(1∶50)，37 ℃避光孵育30 min，PBS漂洗，PI复染细胞核(红色)10 min，50%甘油封固。荧光显微镜下观察，cTnT阳性表达的细胞浆发绿色荧光，细胞核为红色。每孔观察10个视野共30个视野，分别获得肌钙蛋白T阳性细胞比例，计算肌钙蛋白T阳性细胞百分率。阳性对照组与阴性对照组同样实验。

Western-blot检测肌钙蛋白T、结蛋白表达：实验组培养第7天取3孔细胞，采用RIPA蛋白裂解液提取H9C2细胞，间充质干细胞诱导后，间充质干细胞诱导前蛋白，用BCA法测量蛋白浓度。制备10%聚丙烯酰胺分离胶，将上述样品等量上样(50 μg)，SDS-PAGE电泳，上层胶恒压80 V，30 min，下层胶恒压100 V，80 min，电泳结束后，湿转(恒流250 mA，1 h)。转膜完毕后，将PVDF膜放于5%脱脂奶粉封闭1 h，加入山羊抗鼠的单克隆一抗cTnT(1∶500)，山羊抗鼠的单克隆一抗desmin(1∶300)，4 ℃孵育过夜。PBS洗涤3次，10 min/次，然后将PVDF膜加入兔抗山羊IgG(1∶3 000)，室温孵育2 h后，PBS洗涤3次，5 min/次。采用ECL化学发光试剂在化学发光仪下显色。采用Quantity one进行灰度分析，结果用目的蛋白与β-actin的比值表示，实验重复3次。阳性对照组与阴性对照组同样实验。

实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测细胞心肌特异因子的表达：实验组培养第7天取3孔细胞，按照Trizol试剂说明书分别提取各组细胞的总RNA，依据反转录系统说明书采用以Oligo-dT 15-18为引物反转录为cDNA；α-肌球蛋白重链，β-肌球蛋白重链和β-actin引物与TaqMan水解探针由上海生工生物有限公司设计合成。

实时荧光定量PCR步骤：采用25 μL体系，各组反应体系分别加入12.5 μL Prem ix Ex Taq，引物各1 μL(10 μmol/L)，探针0.5 μL(10 μmol/L)，0.5 μL ROX R eference Dye， cDNA 1 μL为模板，加水补至25 μL。反应条件为：94 ℃ 3 min，94 ℃ 15 s(40个循环)，60 ℃ 1 min，实验重复3次。PCR结束后收集Ct值，本实验使用2^-^△△CT法对实验数据进行分析^[15]。阳性对照组与阴性对照组同样实验。

主要观察指标：①骨髓间充质干细胞肌钙蛋白T阳性细胞率。②骨髓间充质干细胞肌钙蛋白T、结蛋白的表达。③H9C2培养液诱导间充质干细胞后分化细胞α-肌球蛋白重链，β-肌球蛋白重链mRNA表达。

统计学分析：使用SPSS 18.0统计软件分析，多组间比较采用单因素方差分析，以P < 0.05差异有显著性意义。

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讨论

骨髓间充质干细胞是一种少见的非造血干细胞，属于成体干细胞的一种，具有强大增殖能力以及多向分化潜能，目前诱导间充质干细胞向心肌细胞定向分化的研究已是组织工程再生研究热点课题。

因为间充质干细胞具有来源充足、取材方便、自体移植无免疫排斥等优势，是一种理想的心肌供体细胞。目前骨髓间充质干细胞的分离培养方法常用的有^[16]：密度梯度离心法、免疫磁珠分选法、全骨髓贴壁筛选法等。密度梯度离心法的不足之处是此途径获得的细胞数量较少^[17]；免疫磁珠分选法虽可获得相对纯度较高的细胞，但其技术与操作均较复杂，且易损伤细胞^[18]。全骨髓贴壁筛选法是将大鼠骨髓经过冲洗髓腔培养，通过换液传代，贴壁的非造血干细胞得以保留，而不贴壁的造血干细胞在换液中被去除，经过连续的换液与传代，便可得到纯度高的骨髓间充质干细胞。操作简单、不易污染、成本低，对细胞的损伤最小。因此，实验中采用全骨髓贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞。

骨髓间充质干细胞表面抗原具有多样性，表达多种黏附因子如CD44、CD29，可作为鉴别间充质干细胞的表面抗原，不表达造血干细胞所具有的表面标志物如CD19、CD45、CD34等。通过流式细胞仪检测CD44、CD29、CD45、CD34等不同表面抗原可对骨髓间充质干细胞进行鉴定^[19-20]。研究显示通过全骨髓贴壁筛选法分离培养的细胞，经过连续的更换培养液及传代^[21]，不贴壁的造血干细胞在换液中被去除，而贴壁的非造血干细胞纯度显著增加，传至第2代时CD44的阳性率99.11%，而造血干细胞CD45的表达极低，形态学观察显示形态及生长良好，表明全骨髓贴壁筛选法可获得纯度高的骨髓间充质干细胞。

目前所知诱导间充质干细胞向心肌细胞分化的方法均不理想，即细胞分化方向不完全一致心肌细胞分化率太低，难有适用价值。较早的研究显示间充质干细胞间充质干细胞可以被化学物质5-氮杂胞苷诱导为心肌样细胞^[22-23]。王海萍等^[24]研究中，二甲基亚砜诱导后的间充质干细胞形态和排列开始出现变化，长梭形细胞可观察到，细胞极化方向渐趋一致，可检测到诱导后的间充质干细胞表达结蛋白、肌钙蛋白I。但观察显示化学物质对细胞有不同程度的损伤。寻找间充质干细胞向心肌细胞定向分化的诱导因素是当前的重要任务。

有研究者将新生乳鼠的心肌细胞分离、并制成心肌细胞裂解液，用含有心肌细胞裂解液的培养基培养间充质干细胞，1周后细胞形态出现长梭形的成肌细胞形态的改变，通过免疫组化分析发现表达肌动蛋白和肌钙蛋白T^[25]。H9C2细胞系是来自于大鼠心脏组织的亚克隆细胞系，具有心肌细胞的电压门控Ca²⁺通道^[26]；Hescheler等发现H9C2有膜电流产生，能表达对二氢吡啶敏感的钙离子通道，并能对F8-肾上腺素能刺激作出反应，具有类似心肌细胞的表达肌钙蛋白属性等^[27-29]。H9C2细胞培养液中含有心肌细胞生长因子及有利于维持心肌细胞特性的细胞因子。本实验中，用H9C2细胞培养液作为诱导因素培养间充质干细胞，结果显示间充质干细胞经诱导培养后表达心肌特异性蛋白肌钙蛋白T及结蛋白，诱导培养7 d时肌钙蛋白T阳性细胞率达(16±7)%。表明H9C2细胞培养液诱导后的间充质干细胞具有向心肌细胞分化的潜能。目前，未见用H9C2细胞培养液作为诱导因素的报道。

间充质干细胞分化为心肌细胞的机制目前尚不清楚，可能与多种基因及信号通路的参与调解细胞的增殖反应与调控干细胞的分化有关。近年来，研究表明micro-RNA-1及micro-RNA-499等具有诱导间充质干细胞向心肌细胞分化的功能^[30-31]。有研究报告，经miRNA-1质粒转染后的间充质干细胞，培养数天后用RT-PCR检测心肌重要转录因子GATA4、NKx2.5和MEF2C的mRNA表达,结果显示GATA4、NKx2.5和MEF2C的mRNA表达逐渐增强^[31]，延长培养时间可见肌钙蛋白I阳性表达细胞。间充质干细胞向心肌细胞分化可能与诱导后细胞启动Nkx2.5、GATA4、TBX5等转录因子有关。陈炜等^[32]将心脏早期转录因子Nkx2.5、GATA4、TBX5转染骨髓间充质干细胞，Real Time PCR检测心肌相关基因Cx43、β-肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链2的表达，显示转染后的骨髓间充质干细胞在基因和蛋白水平表达心肌源性特异标志物肌钙蛋白T、Cx43、β-肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链2，具有发育早期的心肌细胞结构特点。此外，信号通路的开关也影响到间充质干细胞向心肌细胞的分化。SDF-1-CXCR4通路可促进间充质干细胞向心肌组织的迁移，经典Wnt通路的抑制可促进间充质干细胞向心肌细胞的分化，而Notch信号通路的激活亦可促进此过程^[33-35]。H9C2细胞培养液能诱导间充质干细胞分化为心肌样细胞机制不清楚，诱导间充质干细胞定向分化为心肌样细胞的效率也不是太高，进一步将通过浓缩诱导培养液分析提纯各组分的方法深入研究。

H9C2细胞培养液诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

Differentiation of mesenchymal stem cells into cardiomyocyte-like cells induced by H9C2 cell culture medium

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[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
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[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
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[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.